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免疫細(xì)胞治療是一種新興的腫瘤治療方式，已成為惡性腫瘤治療研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。自2010年首次進(jìn)入臨床， CAR-T療法備受關(guān)注，在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、尤其是復(fù)發(fā)難治性淋巴瘤上展現(xiàn)了極大的優(yōu)勢(shì)，成為科研和醫(yī)療圈的熱點(diǎn)。2021年，兩款CAR-T療法在國(guó)內(nèi)獲批上市。2022年，第一款完全國(guó)產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品獲得FDA批準(zhǔn)上市，我國(guó)也邁入了細(xì)胞治療的商業(yè)化時(shí)代。
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CAR-T技術(shù)原理
CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell），嵌合抗原受體T細(xì)胞療法，是指人為地給正常T細(xì)胞加入（嵌合）特定抗原的受體，以使T細(xì)胞行使特異的殺傷功能。當(dāng)這個(gè)抗原為癌細(xì)胞表面的抗原時(shí)，T細(xì)胞就可以特異地和癌癥細(xì)胞結(jié)合，從而通過細(xì)胞殺傷作用對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷。在臨床上，CAR-T細(xì)胞治療首先需要采集患者的外周血收集T細(xì)胞。T細(xì)胞通過病毒載體轉(zhuǎn)入特定的CAR基因，并在體外進(jìn)行刺激擴(kuò)增，隨后CAR-T再回輸給患者，在患者體內(nèi)行使其被設(shè)定的腫瘤殺傷作用。
圖 1 CAR-T細(xì)胞療法的臨床操作
和T細(xì)胞類似，CAR-T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞通過免疫突觸結(jié)合后會(huì)通過三種機(jī)制來(lái)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。
第一，CAR-T細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶，穿孔素可以在腫瘤細(xì)胞表面“打洞”，隨后顆粒酶被輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，直接通過物理作用對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷或者誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；
第二，CAR-T細(xì)胞表面還會(huì)高表達(dá)TNF配體，這些配體可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；
除以上兩種機(jī)制外，CAR-T細(xì)胞還會(huì)分泌特定的細(xì)胞因子，因此這些細(xì)胞可以促進(jìn)CAR-T的活性，改變腫瘤微環(huán)境，進(jìn)一步增強(qiáng)其抗腫瘤活性。
圖2 CAR-T細(xì)胞通過三種機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞示意圖
CAR-T發(fā)展歷程
CAR-T細(xì)胞主要由三部分組成，即胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)域，由抗體的單鏈可變區(qū)域（scFv)與T細(xì)胞表面受體嵌合于T細(xì)胞上。胞外區(qū)常為單鏈抗體（scFv)，負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合靶抗原；跨膜區(qū)是鉸鏈或間隔區(qū)，可將scFv錨定于細(xì)胞膜上；胞內(nèi)信號(hào)域由共刺激因子和CD3信號(hào)域組成。當(dāng)抗原被識(shí)別和結(jié)合后，產(chǎn)生刺激信號(hào)傳至胞內(nèi)信號(hào)域，T細(xì)胞被激活并發(fā)揮效應(yīng)功能。
圖 3 CAR-T細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)
第一代CARs由胞外抗原識(shí)別區(qū)即單鏈可變片段（scFv）組成，融合跨膜區(qū)和T細(xì)胞受體（TCR）CD3ζ 分子胞內(nèi)信號(hào)域。然而，由于一代CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增慢和持久性差，在臨床試驗(yàn)中療效甚微。
第二代CARs包含一個(gè)共刺激域，其衍生自CD28或4-1BB結(jié)構(gòu)域，位于跨膜區(qū)和CD3信號(hào)傳導(dǎo)域之間。Carl H. June 團(tuán)隊(duì)在第一代CAR-T的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了以CD19為靶點(diǎn)，4-1BB做共刺激結(jié)構(gòu)域的第二代CAR-T。其衍生產(chǎn)品在2017年獲FDA批準(zhǔn)，成為全世界第一個(gè)上市的CAR-T產(chǎn)品。
第三代CARs使用了慢病毒作為轉(zhuǎn)染載體，可攜帶更大的基因片段進(jìn)入T細(xì)胞。第三代CARs 在胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域加上了第二個(gè)共刺激分子，增強(qiáng)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，后續(xù)發(fā)展了多代CAR分子。
圖 4 三代CAR-T結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
第四代CAR-T細(xì)胞，也稱為精準(zhǔn)CAR-T細(xì)胞，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)主要從腫瘤等疾病的精準(zhǔn)治療角度考慮。設(shè)計(jì)思路包括為CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)一個(gè)安全開關(guān)，在CAR的胞內(nèi)部分插入一個(gè)光開關(guān)蛋白LOV2；在CAR的結(jié)構(gòu)中添加自殺基因或者可控性自殺基因（例如某些藥物敏感基因），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存貨時(shí)限的可控；添加細(xì)胞因子或者趨化因子受體結(jié)構(gòu)，從而增加T淋巴細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)，達(dá)到增強(qiáng)殺傷實(shí)體瘤的效果。
為了克服目前CAR-T成本高，制備周期長(zhǎng)，只能采用自體細(xì)胞制備等問題，通用型CAR-T（UCAR-T，第五代CAR-T）已成為未來(lái)重點(diǎn)的發(fā)展方向。目前第五代CAR-T尚處于早期臨床階段。通用型CAR使用BBIR CAR（生物素結(jié)合免疫受體）或SUPRA CAR（split、universal、programmable）這兩種“第三方”系統(tǒng)，拆分胞外抗原靶向結(jié)構(gòu)或T細(xì)胞信號(hào)單位，以賦予CAR-T細(xì)胞識(shí)別多種抗原能力。同時(shí)，從同種異體健康受體獲取的T細(xì)胞，可在體外通過基因編輯技術(shù)（ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9）破壞T細(xì)胞的TCR基因和HLA Ⅰ類基因，克服移植物抗宿主病（IGvHD）。
行業(yè)情況
截止到2022年6月，全球已有八款CAR-T療法產(chǎn)品獲批上市（表1）。2017年8月，諾華公司研發(fā)的Kymriah療法獲得FDA批準(zhǔn)用于治療患急性B淋巴性白血病且病情難治或多次復(fù)發(fā)的25歲以下患者，成為全球第一個(gè)獲批的CAR-T療法，開啟了腫瘤免疫治療新篇章。
2021年6月22日，復(fù)星凱特CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品益基利侖賽注射液已正式獲得批準(zhǔn)，標(biāo)志著中國(guó)迎來(lái)首款獲批上市的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品，也是中國(guó)首款獲批上市的細(xì)胞藥物。2021年9月3日，藥明巨諾靶向CD19的CAR-T產(chǎn)品阿基奧侖賽注射液獲批，適應(yīng)癥為用于治療經(jīng)過二線或以上系統(tǒng)性治療后成人患者的復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤（r/r LBCL）。這是國(guó)內(nèi)第2款獲批的CAR-T產(chǎn)品，同時(shí)也是全球第7款獲批的CAR-T產(chǎn)品。
2022年2月，由強(qiáng)生（Johnson ＆ Johnson）旗下楊森公司（Janssen）和傳奇生物合作開發(fā)的BCMA CAR-T產(chǎn)品西達(dá)基奧侖賽（cilta-cel）獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于治療復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤成人患者（MM），成為FDA批準(zhǔn)的第二款靶向BCMA的CAR-T療法。
表 1 全球已上市CAR-T產(chǎn)品
全球范圍內(nèi)的CAR-T療法行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)依然激烈，Clinical Trail上有370余項(xiàng)CAR-T臨床試驗(yàn)進(jìn)入Ⅰ期、Ⅱ期階段。國(guó)內(nèi)布局CAR-T進(jìn)入臨床階段的企業(yè)超過20家，CD19、BCMA依然是熱門靶點(diǎn)，形成差異化競(jìng)爭(zhēng)的科濟(jì)藥業(yè)和傳奇生物也有布局針對(duì)實(shí)體瘤的CLDN-18.2等靶點(diǎn)。
圖 5 國(guó)內(nèi)主要CAR-T企業(yè)進(jìn)展情況
目前，關(guān)于CAR-T治療的研究已經(jīng)不僅限于血液系統(tǒng)腫瘤，在如肺癌、肝癌、腸癌等實(shí)體腫瘤領(lǐng)域已經(jīng)取得了一定的突破。相信CAR-T療法在未來(lái)將突破毒副作用、T細(xì)胞衰竭等限制，實(shí)現(xiàn)療效更好、安全性更高、副作用更低同時(shí)價(jià)格也更實(shí)惠的細(xì)胞免疫療法。
未來(lái)發(fā)展方向
目前CAR-T細(xì)胞治療還存在脫靶效應(yīng)、細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)毒性等主要毒副作用。同時(shí)，根據(jù)Allogene、CRISPER等UCAR-T開發(fā)領(lǐng)先企業(yè)的最新臨床數(shù)據(jù)，UCAR-T也存在相比于自體T細(xì)胞治療效果有所折減，長(zhǎng)期療效表現(xiàn)不盡人意的問題。UCAR-T療效打折很大一部分原因是機(jī)體對(duì)供體T細(xì)胞的清除。為了克服以上的缺點(diǎn)，CAR-T療法加速了在尋找腫瘤新靶點(diǎn)、研究信號(hào)機(jī)制和開發(fā)新技術(shù)方面的步伐。
一.在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面。新一代CAR為了克服CAR-T丟失精準(zhǔn)性的效應(yīng)，如圖6所示涌現(xiàn)了多種思路。例如雙(多)靶CAR-T細(xì)胞：可以在T細(xì)胞表面表達(dá)識(shí)別兩(多)種不同腫瘤抗原的抗原受體結(jié)構(gòu)（scFv），防止由于腫瘤抗原丟失引起的腫瘤細(xì)胞逃逸?；诳贵w的開關(guān)設(shè)計(jì)（通用CAR-T）:只有識(shí)別特異抗原的抗體結(jié)合到CAR上，T細(xì)胞才會(huì)被激活。syn-Notch受體CAR-T：當(dāng)scFv識(shí)別抗原后，進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)識(shí)別另一個(gè)抗原的CAR，當(dāng)腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)這兩種抗原的情況，T細(xì)胞才會(huì)被激活等等。
圖 6 新一代CAR-T的不同設(shè)計(jì)示意圖
二.在拓展適應(yīng)癥方面。目前，Car-T 在血液瘤的研究相對(duì)較為成熟，全球開展了大量臨床試驗(yàn)探索 CD19外的新靶點(diǎn)。目前有應(yīng)用價(jià)值的針對(duì)惡性 B 細(xì)胞腫瘤的臨床前和臨床靶標(biāo)還包括CD22、CD20,ROR1,CD37、BCMA等。
與血液瘤相比，實(shí)體瘤CAR-T的開發(fā)難度更大，難點(diǎn)包括抗原異質(zhì)性強(qiáng)缺乏理想的靶點(diǎn)、需要克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤微環(huán)境下轉(zhuǎn)運(yùn)和浸潤(rùn)能力差、內(nèi)源性T細(xì)胞抑制信號(hào)降低CAR-T活性等。2016年，Claudin18.2靶向的人鼠嵌合IgG1單抗藥物Zolbetuximab（IMAB362）展示了治療晚期胃癌的臨床數(shù)據(jù)，Claudin18.2成為了國(guó)內(nèi)外胃癌、胰腺癌抗體藥物治療的熱門靶點(diǎn)。2022年3月，科濟(jì)藥業(yè)CT041進(jìn)入確證性Ⅱ期臨床試驗(yàn)，用于治療晚期胃癌/食管胃結(jié)合部腺癌，成為全球首個(gè)且唯一進(jìn)入到確證性Ⅱ期臨床試驗(yàn)、針對(duì)實(shí)體瘤的CAR-T在研產(chǎn)品。未來(lái)， CAR-T技術(shù)在實(shí)體瘤方面的治療效果值得期待。
三.通用型CAR-T產(chǎn)品仍然是未來(lái)CAR-T細(xì)胞治療的重要發(fā)展趨勢(shì)。一方面，更多細(xì)胞來(lái)源有待探索，包括外周血單核細(xì)胞、臍帶血衍生的T細(xì)胞以及由體細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)得來(lái)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)。二是有望通過基因編輯技術(shù)克服異體來(lái)源CAR-T細(xì)胞的免疫難題。通過CRISPR/Cas技術(shù)基因敲除或破壞供體上的TCR基因，同時(shí)將負(fù)責(zé)呈遞抗原的HLA類分子敲除，消除移植物抗宿主病（GvHD），降低異體來(lái)源CAR-T細(xì)胞的免疫原性，增強(qiáng)其殺傷、擴(kuò)增活性，延長(zhǎng)存續(xù)時(shí)間。
目前通用型CAR-T仍處于早期臨床探索階段，大部分產(chǎn)品為單靶點(diǎn)，也有部分產(chǎn)品布局CD19/CD22雙靶向。適應(yīng)癥方面，除血液腫瘤領(lǐng)域外，通用型CAR-T療法在實(shí)體瘤領(lǐng)域的開發(fā)也在摸索中，如卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等。今年9月26日，北恒生物公布并發(fā)表了其自主研發(fā)的靶向CD7的通用型CAR-T產(chǎn)品RD13-01治療血液惡性腫瘤的Ⅰ期臨床結(jié)果。11名患者中，客觀緩解率（ORR）為81.8%，綜合緩解率（MRD-CR/CRi）為63.6%，整體表現(xiàn)出較好的安全性和有效性。10月，亙喜生物靶向 CD19 的異體CAR-T產(chǎn)品GC007G注射液進(jìn)入治療復(fù)發(fā)/難治性急性 B 淋巴細(xì)胞白血病的Ⅱ期臨床階段。未來(lái)隨著新技術(shù)的開發(fā)，通用型CAR-T療法有望上市，通過大批量生產(chǎn)降低CAR-T細(xì)胞成本，惠及更多患者。
總而言之，CAR-T療法的發(fā)展，在“深度”和“寬度”上都有著更多有待探索的創(chuàng)新方向。一方面是CAR-T本身技術(shù)的更迭和創(chuàng)新，通過合成生物學(xué)和基因編輯技術(shù)對(duì)CAR結(jié)構(gòu)不斷設(shè)計(jì)、優(yōu)化，以及對(duì)多種抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行開發(fā)。另一方面，隨著CRISPR基因編輯技術(shù)、iPSC、mRNA等技術(shù)不斷更迭發(fā)展， CAR-T療法與創(chuàng)新技術(shù)的結(jié)合有極大的應(yīng)用空間等待挖掘，在靶點(diǎn)、適應(yīng)癥等方面取得突破。
隨著更多技術(shù)難題別攻克，期待未來(lái)CAR-T療法在更多治療領(lǐng)域進(jìn)行推進(jìn)，在商業(yè)化階段進(jìn)行推廣，從末線治療走到前線治療，給癌癥治愈帶來(lái)更多希望。
